4.
Apports de la mesure des rapports isotopiques du carbone des
stéroïdes dans la détection du dopage sportif
Mr M. BECCHI,
Ingénieur de recherche, CNRS, Vernaison.
1/ Introduction
Les stéroïdes sont contrôlés par des techniques de chromatographie gazeuse couplées à la spectrométrie de masse (GC-MS). Ces contrôles se font en 2 étapes. On procède d’abord au screening qui est une étape de dépistage rapide et sensible permettant l’analyse d’un grand nombre d’échantillons. On réalise une seconde étape dans les cas susceptibles d’être positifs. Il s’agit d’une confirmation par des techniques de GC-MS.
Il est relativement facile de détecter des produits synthétiques non naturels dans les urines. Cependant, les stéroïdes endogènes comme la testostérone posent un véritable problème.
La technique actuelle pour établir un dopage à la testostérone est basée sur une analyse GC-MS. On détermine le rapport testostérone (T) sur épitestostérone (E) qui est un isomère de la testostérone. Classiquement, ce rapport est normalement voisin de 1. Dès qu’il y a administration de testostérone, ce rapport augmente. Les normes du CIO considèrent qu’il y a dopage pour un rapport T/E supérieur à 6. Cette règle est toujours soumise à contestation car il existe des cas naturels rares où ce rapport T/E est égal à 9. Le cas le plus délicat est celui du dopage contrôlé où ce rapport est juste inférieur à 6.
2/ L’analyse isotopique du carbone des stéroïdes en pratique
Pour améliorer cette technique, il a été développé une autre approche basée sur l’analyse isotopique du carbone. Il s’agit de la détermination du rapport carbone 12 sur carbone 13. Dans la nature, la matière organique contient environ 1% de C13. Cependant, suivant la nature de la matière organique, ce 1% va varier très légèrement et va être caractéristique de l’origine de la molécule.
Les premières applications de cette technique analytique isotopique ont été mises en œuvre par la répression des fraudes, notamment dans le domaine agro-alimentaire.
La testostérone synthétique est préparée à base de stérols végétaux. Le pourcentage de C13 est alors différent de celui de la testostérone naturelle.
Une analyse isotopique se réalise de la façon suivante. La matière organique doit être transformée en gaz carbonique par combustion. Le gaz carbonique formé est ensuite analysé par spectrométrie de masse. Toutes les mesures sont faites par rapport à un étalon international qui est un carbonate de fossile.
Dans un premier temps, il a été tenté de mesurer la teneur en stéroïdes urinaires. Les échantillons sont purifiés par extraction en phase solide. La plupart des métabolites sont éliminés sous forme sulfo ou glucuronoconjuguée. Il y a donc une étape d’hydrolyse enzymatique préliminaire.
On ne mesure pas le taux de stéroïdes en valeur absolue car il dépend fortement du régime alimentaire. On mesure la testostérone ainsi que des métabolites et des stéroïdes précurseurs. Chaque individu est ainsi son propre témoin. Cette technique a été prévue comme une méthode de confirmation lorsque le rapport T/E est supérieur à 6. Cette technique nécessite une lourde préparation qui ne permet pas une application sur des centaines d’échantillons comme dans le cadre de Jeux Olympiques.
Il a fallu changer les habitudes d’analyse de ces stéroïdes car ils sont le plus souvent analysés sous forme de dérivés triméthylsilylés. Ces dérivés ne sont pas très compatibles avec l’analyse isotopique entre autre parce qu’on apporte beaucoup de carbone étranger à la molécule. Le dérivé de choix dans ces conditions est le dérivé acétate. Cette méthode permet donc de mesurer la testostérone, des précurseurs et des métabolites.
Différents précurseurs ont été choisi. Au début, on utilisait des métabolites de la DHEA mais celle-ci est en vente libre aux Etats-Unis. Le précurseur le plus utilisé est le pregnanediol qui est un métabolite de la progestérone.
Actuellement, des laboratoires travaillent sur des métabolites très concentrés dans les urines mais moins spécifiques que les androstanediols. Il s’agit de l’androstérone et l’étiocholanolone. Le problème est que ces métabolites proviennent aussi bien des corticostéroïdes que des stéroïdes anabolisants. Il semblerait cependant que les dérivés androstanediols permettraient une détection plus longue dans le temps.
Récemment, cette technique a été mise en œuvre sur d’autres types de stéroïdes. En effet, les corticostéroïdes sont toujours très largement utilisés dans certains sports comme le cyclisme. Les produits recherchés pour le cortisol ou la cortisone existent à des concentrations relativement faibles dans l’urine et sont le plus souvent conjugués. Cependant, les métabolites sont nettement plus concentrés donc plus faciles à analyser.
Le premier dérivé de corticostéroïdes ayant été testé est un dérivé bisméthylènedioxy. Ce dérivé est intéressant car il permet de n’introduire que 2 carbones supplémentaires à la molécule de base. Il y a donc une modification très mineure de la valeur isotopique et ce sont des produits ayant un comportement chromatographique intéressant.
D’autres méthodes de dérivation plus efficaces ont été testées . L’oxydation totale permet d’obtenir un dérivé ayant des caractéristiques chromatographiques plus intéressantes. L’autre avantage est que tous les dérivés 5 alpha, THE, THF, hexahydrocortisone (cortolone) et hexahydrocortisol (cortol) donnent le même dérivé ce qui aboutit à une sensibilité énorme. Ceci permettrait de travailler avec moins de 2 ml d’urine.
Les laboratoires Roussel-Uclaf et le CNRS viennent conjointement de déposer un brevet pour la fabrication de stéroïdes à partir de génie génétique. Il y a obtention, à partir de levures modifiées en présence d’alcool, d’une base d’hémisynthèse, la pregnenolone. En fonction de la source de carbone donnée à la levure (alcool de betterave ou alcool de canne à sucre), les mesures isotopiques de la pregnenolone varient. Même avec cette autre origine des stéroïdes, la différenciation avec les stéroïdes naturels humains restera possible.
3/ Questions
· Combien d’échantillons peut-on traiter par jour par cette méthode ?
Actuellement la méthode est utilisée par le CIO comme une technique de confirmation. Cela concerne quelques échantillons par mois. Cette technique est en phase de mise en place. Il est prévu qu’elle soit utilisée en screening pour les JO d’Athènes en 2004. Elle sera même probablement utilisée à Sidney.
· Quel est le coût de cette technique ?
L’appareillage coûte environ 1 million de francs sans compter le personnel. D’un autre côté, les investigations devraient être plus rapides qu’aujourd’hui.
· Est-ce-qu’on peut appliquer ces méthodes à la nandrolone ?
C’est en cours d’essai mais le gros problème est la sensibilité. En effet, les concentrations de nandrolone sont 20 fois moins importantes que celles de testostérone. Techniquement ce serait possible mais le coût de l’appareil en serait plus cher et il faudrait un échantillon urinaire plus important.
· Jusqu’à combien de temps après la prise peut-on détecter la substance ?
Cela dépend de la dose de stéroïdes mais c’est détectable pendant quelques jours après la prise. Cependant, l’analyse isotopique est plus efficace que le rapport T/E qui redevient très rapidement normal. De plus, des différences ethniques ont été montrées entre les caucasiens et les asiatiques pour le rapport T/E.